| 单词 | 细菌抗砷特性 |
| 释义 | 【细菌抗砷特性】 1968年，Novick等对金黄色葡萄球菌进行的研究表明，该菌的砷抗性与3个质粒(现已知是pI258、pI147和pI524)有关，决定砷酸盐和亚砷酸盐抗性的遗传决定子是相互独立的。1973年，Hedges等在大肠杆菌中发现质粒R773对砷酸盐和亚砷酸盐具有抗性。并证明了在革兰氏阳性菌的革兰氏阴性菌中决定砷抗性的是质粒，为从分子和基因水平上了解细菌抗砷机理打下了基础。1981年，Silver等发现了大肠杆菌和金黄葡萄球菌的砷抗性是可诱导的，砷酸盐、亚砷酸盐和亚锑酸盐都可作为诱导物，抗性质粒的存在不改变大肠杆菌已有的磷酸盐吸收系统，表明抗性质粒提供了一个专一性的砷酸盐转移系统。1982年，Silver和Keach以及Mobley和Rosen都证明了在大肠杆菌中，由质粒控制的对于砷酸盐、亚砷酸盐和亚锑酸盐的抗性包括一个初级的含氧阴离子泵的作用，该作用不依赖电化学的质子梯度，而是利用细胞内的ATP作为阴离子转移的直接化学能。1983年，Mobley等首先将大肠杆菌质粒R773上的4．3kb抗砷片段克隆到质粒pBR322中，得到一个重组抗砷的质粒pUM3，证明了在大肠杆菌中决定抗砷特性的是一个单一基因簇编码的含氧阴离子转移系统，此基因簇位于91kb的抗性质粒R773上，称为ars操纵元，该操纵元可被元素周期表第Ⅴ族元素的含氧阴离子诱导。Chen等(1986)和San Francisco等(1990)分别对大肠杆菌ars操纵元进行了序列分析，证明了该操纵元含有4个基因，分别命名为arsR，arsA，arsB，arsC基因。1992年，Ji和Siver将含有抗砷决定子的金黄色葡萄球菌质粒pI258以两种方向克隆到质粒pSK265中，得到质粒pGJ101和pGJ102，这两个质粒都表现出了与pI258相同的抗砷酸盐、亚砷酸盐和亚锑酸盐的特性，说明砷抗性与与pSK265的阅读架(ORF)方向无关。另外，他们将pI258克隆到质粒pUC19的LacZ基因位点中，得到一个新的抗性质粒pGJ103，将该质粒转入大肠杆菌中，发现转化子对砷酸盐和锑酸盐有较低水平的抗性，对亚砷酸盐则有较强的抗性，说明葡萄球菌的抗砷决定子能够在大肠杆菌中发挥作用。通过对pI258的序列分析，他们证明了在pI258中，决定砷抗性的主要是3个基国：arsR，arsB，arsC。以上实验结果表明，大肠杆菌的ars操纵元与金黄色葡萄球菌的ars操纵元在结构上不完全相同。在金黄色葡萄球菌中，与大肠杆菌arsA基因同源的基因是缺失的，arsR基因与arsB基因直接相连。但这两种菌的抗砷过程非常相似，都是由arsR基因编码的阻遏蛋白ArsR调控的。 ArsR蛋白的特性 利用启动子探测载体，从质粒R773上克隆到的727bp的EcoRI-HindⅢ片段与ars操纵元的抗砷调控有关，这一片段包含了arsR基因，其基因产物ArsR蛋白经证明是一种反式作用调节蛋白，分子量为13kD，尽管它必须结合到DNA的操纵部位才能发挥作用，但未发现有可识别的DNA结合位点。另外，质粒R773的砷抗性是诱导型的，而重组质粒pUM3的砷抗性则是组成型的，这说明在pUM3中起调控作用的arsR基因缺失，现证明在pUM3中操纵元结构基因的表达依靠质粒pBR332的P1启动子。菌体抗砷的快速调控通过许多不同的含氧阴离子进行，这些阴离子包括砷酸盐、亚砷酸盐和亚锑酸盐等。利用arsR基因与β－内酰胺酶基因(blaM)的融合实验发现，β－内酰胺酶在靠近ArsR蛋白(共117个残基)的C末端(102或105残基处)融合形成的嵌合蛋白保持了ArsR的调节活性。因此，基因的表达是诱导型的，而在靠近N末端(10～83残基处)融合形成的嵌合蛋白则失去调节作用，基因的表达是组成型的。但当arsR基因与这些组成型融合子在一起以反式方式表达时，其调节活性仍能保持。现已搞清arsR基因的下游DNA序列对于调节不是必需的。综上可以得出结论，arsR的表达是自动调节的，在没有砷诱导物存在时，ArsR蛋白抑制表达，而当诱导存在时，表达可顺利进行。因此，尽管ArsR蛋白较小，又明显地缺乏DNA结合位点，但ArsR蛋白确是一种反式作用抑制物。ArsA蛋白的结构与作用 由arsA基因编码的ArsA蛋白已被纯化，是一种外周膜蛋白，并经证明是一种可被含氧阴离子激活的ATP酶，严格要求亚砷酸盐或亚锑酸盐为其底物，其余的含氧阴离子，如砷酸盐或磷酸盐都不能替代。ArsA蛋白是63kD的蛋白质分子，其N－，C－末端相互间表现出同源性，这是基因在进化过程中发生了复制和融合的结果。研究发现ArsA蛋白不同于以往发现的离子转移ATP酶，因为对离子转移ATP酶有抑制作用的物质，对ArsA蛋白活性没有影响。目前看来ATP似乎是ArsA蛋白唯一的核苷酸底物，而GTP、UTP、CTP或ITP的水解与ATP相比，活性小于15%，但ArsA对于ATP的结合和水解是两个不相关的部分。ArsA与ATP结合时不需要含氧阴离子，而ArsA以ATP酶形式发挥作用时，则需要核苷酸和含氧阴离子。ArsA蛋白同其它蛋白一样，都可被蛋白酶降解。在胰蛋白酶作用下，首先形成一系列较小的片段，然后这些片段在很短时间内被降解掉。但这种作用受ArsA蛋白底物影响。当亚锑酸盐单独存在时，胰蛋白酶可将ArsA降解，说明ArsA与含氧阴离子底物结合时，其表面构象保持相对的稳定；当ATP单独存在时，胰蛋白酶对ArsA只有部分降解作用，说明ArsA结合核苷酸底物后，其表面构象发生了变化，不利于蛋白酶的作用；当ATP和亚锑酸盐都存在时，ArsA蛋白形成的酶维持其原来的状态，几乎不被胰蛋白酶降解，这说明该蛋白与阴离子和核苷酸结合的区域是不同的，而且单独与1种底物结合同与2种底物同时结合时的表面构象完全不同。现已搞清，由ArsA蛋白构成的具有催化能力的酶是由2个63kDArsA蛋白分子组成的二聚体。通常ArsA以单聚体和二聚体混合的状态存在，单聚体可聚合成二聚体，二聚体也可解聚成单聚体，二者维持着动态平衡，当加入阴离子后，这种平衡即被打破，向着形成二聚体的方向进行。所以阴离子在催化过程中的一个作用就是诱导形成二聚体。研究结果证明，ArsA蛋白的每一个单聚体上有2个内在的核苷酸结合部位(在二聚体上有4个)，尽管这两个部位相互间很相似，但它们不是等同的，功能也有差别。2个部位都有催化作用，或它们相互间发生作用，现在还不清楚。arsA基因是目前仅在大肠杆菌中发现的抗砷结构基因，它与arsR基因之间间隔着一段439bp的核苷酸序列。但在金黄色葡萄球菌中arsA基因缺失，而其砷化物排出系统也是依赖能量的。能量的来源大致有2种可能性：其一，葡萄球菌的排出系统中含有由染色体基因编码的ATP酶亚单位，水解ATP以供给排出系统所需的能量；其二，由不同的系统(如质子动力)供给必需的能量，但二者都没有被证实。实验表明，葡萄球菌的ars操纵元在大肠杆菌中和在葡萄球菌中抗亚砷酸盐的浓度大致相等，但在大肠杆菌中未检测出砷酸盐抗性。arsB基因的表达特点及ArsB蛋白的作用 arsB基因是大肠杆菌和葡萄球菌所共有的。由arsB基因编码的ArsB蛋白，分子量为45．5kD。它在大肠杆菌和葡萄球菌中大小基本相同，其整体氨基酸组成的相似性达58%。初步证明arsB基因产物是一个整合到膜上的蛋白，位于大肠杆菌膜内侧。arsB基因的表达不依赖该基因的剂量，砷化物的排出和抗性是受位于膜上的ArsB蛋白的量限制的。ArsA蛋白存在于胞质中，当有ArsB蛋白存在时，ArsA蛋白通过ArsB蛋白与膜内侧结合(在膜外侧未发现ArsA蛋白)，构成了膜结合的ATP酶，催化含氧阴离子的转移。已证明ArsA蛋白与膜内侧的结合需要完整的ArsB蛋白，这意味着这两个基因产物间有相互作用，但尚无证明这种相互作用直接的方法。在缺失arsA基因的菌株中，其ArsB蛋白仍可以其功能形式插入到膜中。研究发现不管是以复合体形式从细胞中分离得到的与膜结合的ArsA蛋白，还是在体外结合到分离的膜上的ArsA蛋白，都具有含氧阴离子激活的ATP酶活性。该活性与可溶状态下的ArsA蛋白相近。这些结果说明，arsB基因的表达对于ArsA蛋白与膜内侧的结合必不可少，从而证实了膜组分ArsB蛋白起着将ArsA蛋白固定在膜上的作用这一假设。arsB基因表达不良会限制抗砷的水平。尽管所有的ars基因都包含在同一个多顺反子操纵元中，但它们的表达有差别。ArsA和ArsC蛋白是大量产生的，与操纵元中质粒的拷贝数成正相关。虽然arsC基因位于arsB基因的下游，但ArsB蛋白的量却与ArsA和ArsC蛋白的量相关甚大。那么是什么原因限制了ArsB蛋白的量呢?通过ars mRNA的Northern分析证明，ars操纵元首先转录成为一个总长4400核苷酸的RNA，然后再迅速裂解为两个较小的片段，一个为2700核苷酸，其中包含有arsR和arsA序列，另一个为500核苷酸，包含有arsC序列，而裂解部位恰在arsB序列内。4400核苷酸转录物的半衰期小于4min，而2700和500核苷酸转录物的半衰期大约为10min。对arsB翻译起始区域的分析表明，由于其结构的特殊性，当转录开始时，只会有相当少的核糖体结合在上面，因而易于受核酸内切酶的作用。因此，低效的翻译起始再加上arsB信息的迅速损失，便导致了该蛋白的产量较少，这或许是细胞避免膜蛋白基因的过分表达所形成的普通机制。ArsC蛋白的作用 通过含氧阴离子泵而产生的砷化物的抗性(和转移)除需要arsA和arsB基因产物外，还需要arsC基因产物。arsC基因是ars操纵元中最小的结构基因，其转录产物ArsC蛋白为可溶性的，分子量为15．8kD，位于胞质中。研究发现ArsA和ArsB蛋白对于砷酸盐和亚砷酸盐的抗性是必需的，而ArsC蛋白对亚砷酸盐的抗性和转移并非必需，但对于砷酸盐的抗性和转移则是必不可少的。这意味着ArsC蛋白肯定是以某种方式参与了ArsA和ArsB蛋白的催化过程。Ji等证明ArsC在其它ars操纵元基因产物缺失的情况下，能将砷酸盐还原为亚砷酸盐，后者被ArsB蛋白运出细胞。无细胞提取物的还原检测显示，还原性的硫化合物二硫苏糖醇(DTT)可以强烈地刺激依赖ArsC的砷酸盐还原反应。纯化的ArsC蛋白在加入DTT和硫氧还原蛋白时，可将砷酸盐还原为亚砷酸盐。它是一种砷酸盐还原酶，酶活性存在于胞质中，而不在膜结合的部分或周质中。至于砷酸盐是以何种机制与能量相偶联，目前证据不足。【参考文献】：1 KaurP,Rosen B P. Plasmid, 1992,27:29-402 Mobley H L T.Chen CM,Silver S.et al. Mol. Gen Genet.(山东大学徐海岩、颜望明撰) |
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